一切從傳奇之地開始~
終於來到這個傳說中，不到午夜不熄燈的研究單位。聽說早期的學生跟助理，沒有對科學的巨大熱情是不敢踏進這裡的。當年創立分子生物研究所是為了發展在世界上剛剛起步的分子生物學研究。如今，三十幾年過去了，分子生物研究所已經成為了一個深根基礎、百花齊放的研究機構。
帶著滿心的興奮與期待，八年前，我來到這個傳奇的地方來開始自己的實驗室。過去陸續學習了不同的研究方法，從數學模型、電腦模擬、生物化學、分子遺傳再到系統生物學。研究這條路上，我ㄧ直像是個在糖果屋的小孩，充滿好奇地享受著不同研究方法對生命不同面向的探索。現在第一次可以獨當一面，一心一意就想在自己的實驗室，做一些自己熱愛、嶄新的研究課題。
因為未知，所以投入!
那天下午，進入實驗室不久的助理若曦，皺著眉頭問說：『老師，我很迷惘，我們的研究要往哪裡走？』帶著些微尷尬的笑容，我說：『說真的，我也不知道，我也還在找。但是我知道，我們要走一條跟別人不一樣的路。』
過去十年顯微影像自動化技術的進展，讓科學家能針對每一個細胞做縮時攝影，長時間的記錄蛋白分子與細胞的行為。就像是拍電影，對象是一個個的細胞。我們仔細地觀其言、察其行，想要找到控制細胞行為的分子策略。然而，這個領域大部分的研究都聚焦在蛋白分子，代謝分子的研究相對而言寥寥無幾。一方面是沒有好的量化方法來看代謝分子的行為，另一方面也有人覺得代謝的領域已經過時了（生命科學上的『過時』常常是個誤解，生命裡的豐富與複雜，在未來的數十年應該都會是充滿未知的探索期，就像過去十年代謝領域正經歷著它的文藝復興，很多的研究陸續顛覆了過去對細胞與個體代謝功能的想法。）。
開啟細胞裡的死亡開關~
建立實驗室後的第一個工作，就是自己調配培養細胞的營養基，裡面有數十種成分包括氨基酸、糖與維他命。我們想一個一個的拿掉，來看看細胞有什麼反應。另一方面，我們也尋思使用數學模型來簡化營養代謝的路徑，利用電腦模擬來幫助我們找到重要的分子調控策略。但是偌大的代謝網路，我們要往哪裡走呢？
當助理智堯把糖從營養基拿掉時，細胞會因為缺糖而死亡，但是他發現細胞的死亡時間可以很不一樣，有的細胞幾個小時內就死了，有的卻可以活很久，而且死亡的快慢，似乎被ㄧ種短暫的細胞記憶調控著，第一代的姐妹細胞死亡的時間很相近，但是到了第二代以後，細胞死亡的時間的分歧就越發加大。這樣的發現，讓我們開始想缺糖造成的細胞死亡，會不會被像是開關一樣的機制調控，一旦開啟就無法返回。於是若曦在過往的研究文獻尋找這樣像開關機制的可能途徑。一年以後，已經在史丹佛大學攻讀博士的若曦，建立了一個數學模型，預測細胞在缺糖後的代謝反應，其中一個重要現象就是活性氧化物（Reactive oxygen species）會有像開關一樣的全有全無（all-or-none）反應。也就是說，在細胞缺糖以後，細胞內活性氧化物一旦超過了某一個閥值，就會開啟它生成的正回饋，造成活性氧化物的大量產生，引發細胞因為過度的氧化反應而死亡。
於是剛在博士班就讀的Hannah 跟助理Vivian展開了一系列的實驗，來測試活性氧化物開關機制的想法。很幸運地，當年在莫斯科的一個研究室剛剛發明了一個過氧化氫（H2O2，活性氧化物的一種）的遺傳螢光標記，讓我們可以測量單細胞裡過氧化氫的動態。實驗的結果正如我們的預測一樣，當細胞嚴重缺糖後，過氧化氫在細胞裡的開關就會開啟而且大量生成，因而造成細胞氧化死亡。我們很開心能有這樣的發現，因為這是第一個用量化方式，發現細胞裡活性氧化物的開關機制研究，當時不管在代謝或是單細胞的領域，都是獨出一格的想法與做法。
說明：過氧化氫在單一細胞裡的全有全無反應，黃色螢光是過氧化氫的量。
鐵死亡觸發波!
除了糖，還有其他的營養跟細胞的活性氧化物調控有密切關係，其中之一就是半胱氨酸（cystine）。半胱氨酸是生成穀胱甘肽（glutathione）的必需元素，而穀胱甘肽又是細胞對抗氧化壓力的重要分子。當細胞內的半胱氨酸減少，氧化壓力就會上升，繼而引發因過度氧化的細胞死亡。特殊的是，這種死亡跟細胞缺糖後的死亡不盡相同。半胱氨酸缺乏造成的細胞死亡，跟細胞裡的鐵離子息息相關，鐵離子可以催化細胞膜裡的脂質氧化，進而造成膜破裂。所以這種因為半胱氨酸缺乏造成的細胞死亡又稱為鐵死亡。
剛剛來實驗室的Hannah決定來研究細胞鐵死亡發生的過程中，活性氧化物是不是也會有類似開關的機制。沒有太多細胞培養經驗的她，不小心錯估了細胞量（雖然也有很大的機會是我教錯了…），放了滿滿地細胞在培養皿裡，第二天，她拿縮時攝影的結果跟我分享。
我說：『這個細胞死亡為什麼會像從左到右傳開？會不會是培養皿乾了啊？！』帶著肯定的眼神，Hannah說：『沒有喔，我看了好幾遍，沒有乾。好像是細胞死亡會在空間中傳播開來了！』我瞪大雙眼，連看了這個結果好幾遍，最後興奮地說『如果是真的，那就真的太有趣了！我從來都沒有看過這種現象！讓我們馬上來重複一下這個實驗吧！』。之後的三年半裡，我們日以繼夜、用盡了所有的力氣，就是想要更了解這個細胞鐵死亡是如何傳播的。
說明：兩種螢光揭露鐵死亡觸發波在視網膜上皮細胞的動態傳播過程中涉及脂質過氧化。黃色螢光為過氧化的脂質，白色螢光為死亡細胞，其空間分布意味脂質過氧化發生於細胞鐵死亡之前。
還記得細胞在缺糖的時候活性氧化物會有像開關一樣行為嗎？其實在半胱氨酸嚴重缺乏的時候，活性氧化物也會像開關一樣的開啟。有趣的是，一旦細胞族群裡一些對半胱氨酸缺乏比較敏感的細胞，開啟它們的活性氧化物開關，進而造成鐵死亡的時候，就會在環境中釋放出一些活性氧化物訊號，如果細胞的密度夠高，這活性氧化物訊號就會擴散到旁邊的鄰居細胞，將它們的活性氧化物開關也打開，進而造成這些鄰居細胞的死亡，然後這些鄰居細胞又會再次釋放出活性氧化物訊號，如此周而復返，造成細胞鐵死亡像波浪一樣的傳播。而這種像波一樣的訊號傳遞機制叫做觸發波。與簡單地擴散作用不同，觸發波可以讓訊號（例如：活性氧化物）維持等速、等強度的傳播，其原理就像骨牌效應，一開始倒下的骨牌就像是早期打開活性氧化物開關的敏感細胞，藉由骨牌間的連結，讓骨牌倒下來的訊息，一路傳遞下去。
說明：鐵死亡觸發波的細胞間傳遞機制。
夏天的數學課~
除了實驗，我們也希望針對鐵死亡觸發波，建造一個數學模型。這樣的數學模型可以幫助我們對一個複雜、不容易直觀瞭解的現象，建立系統性、深入的認識。同時，藉由電腦模擬，我們也可以對觸發波的行為做量化的預測，並尋找觸發波特定行為的重要調控機制，比如說影響傳播速度的重要機制是正回饋的強度之類的。
因為這也是我第一次研究觸發波，Hannah, 與我還有有電機工程背景的博士後嘉洲，在那年的夏天就開始我們一週兩到三次的『數學課』。我們搜尋觸發波相關的重要文獻，針對其中的數學模型，做深入的討論，想要藉由對這些數學模型的了解，來建構屬於鐵死亡觸發波的數學模型。這個過程也許就像畫一幅抽象畫一樣，我們想要掌握鐵死亡觸發波的『神韻』，而不是所有的細節。具體上就是決定了最重要的細胞鐵調控機制，把他們用數學方程式寫下來，然後參考實驗量測的數據，來決定參數的數值。最後，請電腦幫我們依照數學方程式與訂定的參數數值來計算出鐵死亡觸發波的傳播行為。在模擬鐵死亡觸發波傳播時，讓我們學習了很多事，最重要的應該就是鐵死亡觸發波的發生與否，幾乎沒有辦法用簡單的實驗結果預測，需要用量化的方法來看活性氧化物開關的存在與否才行。也就是說，觸發波的發生常常會是無預警的突然發生，一旦發生就會造成大面積的細胞死亡。
說明：實驗（上排）與電腦模擬（下排）在鐵死亡壓力增加時，鐵死亡觸發波的發生與傳播。
死亡觸發波真的會發生嗎？
想想，鐵死亡觸發波發生在我們身體裡會造成什麼樣的結果？它如果真的可以無止盡的傳播，那它一旦發生，我們身體裡所有的細胞是不是不久之後就都會相繼死亡呢？這個問題困擾了我們很久。其實，大面積的細胞死亡，在很多狀況會發生。自十九世紀中葉，科學家就觀察到昆蟲的胚胎發育過程中，有大面積細胞死亡的發生，除此之外，器官衰竭之後的細胞死亡常常是橫跨大面積的組織，但是造成這些大面積的細胞死亡的機制至今仍不全然清楚。
有一天，Hannah拿了一篇John W. Saunders, Jr. 1966年的文章給我看，裡面有John他對胚胎發育時期細胞死亡的描述，他說：『細胞壞死就像波一樣的傳播，由近到遠橫掃了胚胎足部中胚層的前後端邊緣…就像是在雕刻胚胎的足部。』在看到了他在將近六十年前，對死亡傳播栩栩如生的描述，我們覺得他看到的應該很有可能就是鐵死亡觸發波，而他用的是雞胚胎！
說明：引述John W. Saunders, Jr.當年對細胞死亡傳播的描述 。
就從把蛋殼打開開始吧～
好，那就讓我們試試看，能不能看到John當年看到的現象！於是我們著手在實驗室裡建立起雞胚胎的研究方法，學習如何觀察雞胚胎的發育。從雞蛋的取得、培養箱的溫、濕度控制到解剖顯微鏡的使用，我們不會的能問就問，我們沒有的能借就借，經歷了將近半年的摸索，對用雞胚胎來做研究總算有些入門的了解，技術上也逐漸能上手了。
當年John沒有太多的分子工具，沒辦法區辨出不同種類的細胞死亡。為了知道細胞鐵死亡是否真的在胚胎足部發生，Hannah試了好幾種的抗體，用不同的染色與切片的方法。經過了一系列的螢光染色實驗，終於讓我們看到了細胞鐵死亡在胚胎足部的痕跡，而且它只發生在胚胎發育了大約七天半的時候。
說明：7.5天的雞胚胎足部的肌肉細胞（粉紅標記）與鐵死亡（黃色標記）的螢光染色。
為了能真正紀錄鐵死亡觸發波的發生，我們發明了一種體外攝影的方法，先把胚胎足部用牙醫的黏牙膠（可防水），固定在玻璃底的培養皿底下，再進行縮時攝影。因為我喜愛觀察胚胎，我就主要負責解剖的工作，而Hannah對共軛顯微鏡很熟，她就負責將胚胎足部固定與接下來的縮時攝影。我們兩人一前一後，形成實驗室裡的『胚胎攝影工作隊』，每每到了週四與週五，當雞胚胎發育到剛好的時間，我們就在實驗桌前，埋頭努力胚胎解剖與足部固定的工作，經過了好幾個月的努力，調整了很多的實驗操作細節後，一個週末的早晨，Hannah傳一個電郵給我，在信上興奮地說：『真的！細胞死亡真的在胚胎足部傳開了！在胚胎足部的中間區域！』。
說明：雞胚胎中的鐵死亡觸發波由遠端向近端肢體區域的動態傳播過程。白色部分為死亡細胞，意味鐵死亡觸發波發生於肢體發育過程。
為什麼胚胎有辦法把鐵死亡觸發波控制在足部的中間區域而不是全面傳開呢？還記得細胞鐵死亡是藉由細胞膜裡的脂質氧化而發生嗎？我們就想，也許胚胎足部的中間區域可能有比較多的脂質，讓鐵死亡觸發波只能在這裡傳播。於是Hannah用了一種影像技術，量測細胞膜裡的脂質，發現胚胎足部的邊緣區域幾乎沒有可以被氧化的脂質，相較於胚胎足部的邊緣區，胚胎足部的中間區域含有大量的脂質，可以被氧化。這就好像放了一堆的乾木材在中間，讓鐵死亡的火只在中間燃燒、擴散。
說明：胚胎足部的中間區域含有大量的非飽和脂肪酸，可以被氧化 。
之後，我們也利用胚胎藥物注射的方式，抑制胚胎裡細胞鐵死亡的發生。我們發現當細胞鐵死亡被抑制時，胚胎足部的肌肉發育會發生問題。一般七天半的雞胚胎，足部的肌肉發育開始形成五大肌肉束，用來控制每一隻腳趾的動作。當細胞鐵死亡被抑制時，肌肉細胞就無法形成肌肉束，此時它們的排列顯得十分混亂而且細胞的數量也明顯地增加。
說明：胚胎足部的肌肉分化受鐵死亡調控。控制組（左）與實驗組（右，鐵死亡受抑制）。
自然是令人讚嘆的雕刻師!
我們的研究，第一次顯示了細胞鐵死亡在胚胎發育過程中扮演了重要的角色，它就像是自然演化出來，雕刻師的手，藉由觸發波的啟動與掌控，來移除胚胎發育時期暫時性、大面積的細胞與組織，藉此，勾勒出生命的輪廓。
未來，還有好多問題我們想探尋解答。例如：鐵死亡觸發波是如何被自然啟動與掌控的？我們可不可以設計人工基因迴路，來掌控鐵死亡觸發波，作為疾病治療的一種新策略？就讓我們拭目以待吧！
致謝
分子生物研究所大大小小的科學家與非科學家們，你們在我們的探索旅程中，不管是科學上的批判或精神上的鼓勵，都是我們最好的養份，讓我們成長，讓我們在一次次跌倒後，還想要咬著牙、站起來。
淑萍，謝謝妳總是熱心幫忙，讓Hannah可以一次次地突破顯微影像上的限制，讓我們看見生命裡的未知。
Ya-chieh，謝謝妳，因為妳的相信與鼓勵，讓我們看到了最好的自己！
還有要謝謝世界上的所有科學家朋友，因為你們，我們可以站在巨人的肩膀上，往前看！
最後要感謝細胞動態實驗室過去與現在的每一位夥伴，因為我們攜手一起走，科學研究這條路，美麗又有趣！
